Minggu, 04 September 2016



Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah S.W.T tuhan yang maha Esa, karena atas berkat rahmat dan hidayah-Nya kami dapat menyelesaikan Laporan Mikrobiologi Pangan ini. Pokok bahasan dalam praktikum ini yaitu “  Pewarnaan Secara Gram ”.
            Kami menyadari dalam laporan ini masih banyak kesalahan dan kekurangan. Oleh karena itu kami mengharapkan kritik dan saran, demi perbaikan dan kesempurnaan laporan kami selanjutnya. Semoga laporan ini dapat bermanfaat bagi kami khususnya dan pembaca pada umumnya.



  Jember, 26 September 2015

                                                                                                                  Penulis







Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berfungsi untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakteri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo, 1991).
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaaan gram bertingkat adalah suatu cara kerja pewarnaan yang paling berguna dalam bakteriologi. Dengan menggunakan cara kerja ini maka bakteri dapat digolongkan menjadi dua golongan yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif (Sutedjo, 1996: 308).
Perbedaan dalam pewarnaaan ini disebabkan oleh adanya variasi dalam lapisan permukaan atau dinding dari kedua jenis sel.
Sel-sel bakteri yang bersifat gram positif adalah bakteri yang mengikat zat warna dasar (utama) dengan kuat, sehingga tidak dapat dilunturkan oleh zat peluntur  dan tidak dapat diwarnai lagi oleh zat lawan. Pada pengamatan mikroskopik, sel-sel bakteri gram positif berwarna biru ungu (violet), sedangkan bakteri gram negative adalah bakteri yang daya pengikatan zat warna dasarnya tidak kuat, sehingga dapat dilunturkan dan dapat diwarnai kembali oleh zat warna lawan, pada pengamatan mikroskopik sel-sel bakteri ini tampak berwarna merah (Sutedjo, 1996: 308). Untuk mengetahui sifat, perbedaan warna sel dan bentuk sel pewarnaan bakteri secara gram baik positif maupun negatife maka dilakukan praktikum ini.

1.2 Tujuan    
1.      Melakukan pewarnaan bakteri secara gram.
2.      Mengidentifikasi sifat gram dari bakteri.
3.      Memperjelas bentuk morfologis bakteri.
4.      Melihat struktur luar dalam sel.
5.      Memperjelas bentuk dan ukuran.



            Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil,  bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 kali atau lebih (Waluyo, 2004).
Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri bermacam- macam yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan, 2007).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991).
Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan ZiehlNelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri Gram negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram negative adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman, 1983).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007).
            Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol dan safranin (Tracy, 2005).


3.1 Alat
2.      Kaca benda
3.      Mangkuk pewarna
4.      Kawat Penyangga
5.      Pipet
6.      Pinset
7.      Lampu spirtus
8.      Botol Penyemprot

1.      Aquades steril
2.      Biakan murni bakteri (E.coli dan S. Aureus) umur 1x24 jam
3.      Larutan ammonium
4.      Oksalat kristal violet
5.      Kertas penghisap
6.      Korek api
7.      Alkohol 70%
8.      Alkohol 95%
9.      Lisol
10.  Sabun cuci
11.  Larutan safranin
12.  Larutan iodium




Tabel 1.  Hasil Pengamatan
No.
Nama koloni
Bentuk
Warna
Gambar
1.
E-Coli
Tidak beraturan
Bening





2.
S-Aureus
Bulat
Merah





3.
E-Coli
Berkoloni
Bening





4.
S-Aureus
Tidak beraturan
Ungu





5.
E-Coli
Bulat
Merah





6.
S-Aureus
Berkoloni
Ungu





7.
E-Coli
Bulat
Merah





8.
S-Aureus
Bulat
Ungu






4.2Pembahasan
            Mikroorganisme yang ada dialam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologis yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali microalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Hadiutomo, 1990).
            Bakteri yang akan dilakukan pewarnaan yaitu bakteri Escherichia Coli dan bakteri Staphylococus Aureus. Bakteri Escherichia Coli adalah bakteri gram negative berbentuk batang yang tidak membentuk spora yang merupakan flora normal di usus. Bakteri Escherichia Coli umumnya merupakan bakteri patogen yang banyak ditemukan pada saluran pencernaan manusia (Anonim, 2013). Bakteri Staphylococus Aureus adalah bakteri gram positif yang menghasilkan pigmen kuning, bersifat aerob fakultatif, tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun kelompok, dengan diameter sekitar 0,8-1,0 µm. Bakteri Staphylococus Aureus berbentuk bulat menyerupai bentuk buah anggur yang tersusun rapi dan tidak teratur satu sama lain (Anonim, 2014).
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar yaitu gram positif dan gram negative, berdasarkan sifat kimia dan fisika dinding sel mereka. Metode ini diberikan nama berdasarkan nama penemunya yaitu ilmuan Denmark Hans Christian Gram 1853-1938 yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan Pneumokokus dan bakteri Kebsiella Pneumonia (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo, 1990).
Perbedaan dua kelompok bakteri ini (gram positif dan gram negatif) didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat) warna ungu dari Kristal Violet selama proses deklorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu Kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin (Anonim, 2013).
Menurut ilmuan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938), dalam melakukan pewarnaan gram diperlukan empat macam pewarnaan dengan fungsi yang berbeda yaitu :
1.      Pewarnaan primer yaitu pewarnaan yang berfungsi dapat memberikan warna pada semua bakteri.
2.      Pengikat yaitu memperkuat ikatan kompleks antara pewarna dengan komponen dinding bakteri.
3.      Penghilang warna (peluntur warna) yaitu memiliki fungsi untuk melarutkan sisa zat warna dan kompleks zat warna dengan lipid pada dinding bakteri.
4.      Pewarna pengganti yaitu memberikan warna pada dinding bakteri yang kehilangan pewarna primernya.

            Pada praktikum pewarnaan secara gram dapat dilakukan dengan langkah kerja sebagai berikut langkah pertama yaitu siapkan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan diatas api Bunsen/ spirtus untuk mematikan kehidupan pada kaca benda tersebut. Teteskan satu tetes aquades steril di atas kaca benda tersebut, secara aseptic ambillah inkulum bakteri yang akan di periksa dengan cara memijarkan jarum ose, lalu letakkan diatas tetesan Aquades steril. Kemudian ratakan pelahan-lahan dan tunggulah sampai kering.  Setelah sediaan kering maka tahap selanjutnya yaitu melakukan fiksasi dengan cara melewatkan bagian bawah dari kaca benda diatas api spirtus. Setelah itu sediaan siap untuk di warnai.
            Letakkan sediaan diatas bak pewarna (mangkuk), lalu teteskan Amoniumoksalat Kristal Violet diatasnya tunggu selama 1 menit. Pada praktikum ini Kristal Violet merupakan pewarna primer yang berfungsi untuk memberikan warna pada semua bakteri. Setelah 1 menit buanglah kelebihan zat warna tersebut ke dalam bak pewarna dan bilaslah sediaan dengan air kran yang mengalir. Pembilasan kaca benda menggunakan air kran yang mengalir bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan.  Teteskan larutan iodium diatas sediaan tersebut, lalu tunggu selama 2 menit. Larutan iodium ini berfungsi untuk menginterpretasikan warna. Buanglah kelebihan larutan iodium kedalam mangkuk dan bilas sediaan dengan air kran yang mengalir. Langkah selanjutnya yaitu teteskan Alkohol 95% di atas sediaan dan biarkan selama 1 menit, dimana Alkohol 95% pada praktikum ini bertujuan untuk melunturkan warna. Buanglah sisa Alkohol 95% ke dalam bak pewarna, lalu bilaslah dengan air kran yang mengalir. Langkah pewarnaan yang terakhir yaitu teteskan larutan safranin diatas median, biarkan selama 30 detik. Larutan safranin merupakan pewarna tertutup pada praktikum ini, dimana pewarna tertutup (pengganti) berfungsi untuk memberikan warna pada dinding bakteri yang kehilangan pewarna primernya. Keringkan sediaan dengan kertas penghisap (tisu) secara hati-hati. Penyerapan air bilasan dengan menggunakan kertas tisu bertujuan untuk agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau perwarna baru yang akan diberikan. Setelah proses pewarnaan selesai, langkah selanjutnya yaitu pengamatan sediaan dibawah mikroskop untuk melihat bentuk dan warna dari bakteri yang diamati. Pemberian laergen atau pewarna pengganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.
            Bakteri yang digunakan pada praktikum pewarnaan secara gram ini yaitu bakteri e-coli dan s-aureus dimana setiap kelompok ada mengalami kegagalan saat praktikum. Adapun hasil-hasilnya sebagai berikut :
1.      Kelompok 1
Untuk bakteri e-coli pada kelompok 1 berbentuk tidak beraturan dan memiliki warna bening. Hal ini tidak sesuai dengan literature dimana bakteri e-coli bersifat gram negative yang seharusnya memiliki warna merah. Kegagalan ini disebabkan karena pada saat pengambilan bakteri yang diulas pada kaca benda terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal dari bukan media padat. Seharusnya jumlah bakteri yang diulas pada kaca benda yang sebelumnya ditetesi aquades steril pengulasannya secara merata atau satu arah (sutedjo,1991).
Untuk bakteri s-aureus memiliki bentuk bulat dan berwarna merah. Bakteris-aureus merupakan bakteri yang bersifat gram positif, dimana pada saat pewarnaan secara gram menghasilkan warna ungu. Sedangkan hasil praktikum diketahui bahwa bakteri s-aureus berwarna merah. Hal ini tidak sesuai dengan sifat dari bakteri s-aureus dan literature. Menurut ilmuan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938) menyebutkan bahwa bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metal ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. 
2.      Kelompok 2
Untuk bakteri e-coli pada kelompok 2 berbentuk tidak beraturan dan memiliki warna bening. Hal ini tidak sesuai dengan literature dimana bakteri e-coli bersifat gram negative yang seharusnya memiliki warna merah. Kegagalan ini disebabkan karena pada saat pengeringan dengan kertas tisu pada kaca benda sebelum dilakukan pengamatan mikroskop tidak dilakukan secara hati-hati. Seharusnya jumlah bakteri yang diulas pada kaca benda yang sebelumnya ditetesi aquades steril pengulasannya secara merata atau satu arah (sutedjo,1991).
Bakteri s-aureus berbentuk tidak beraturan titik. Memiliki warna ungu. Untuk warna bakteri ini sudah sesuai literature yang menyebutkan bahwa bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu dibawah mikroskop (Aditya, 2010). Bentuk dari bakteri s-aureus pada saat praktikum yaitu tidak beraturan hal ini tidak sesuai dengan literature yang menyebutkan bahwa bakteri Staphylococu Aureus berbentuk bulat menyerupai bentuk buah anggur yang tersusun rapi dan tidak teratur satu sama lain (Anonim, 2014).
3.      Kelompok 3
Hasil praktikum kelompok 3 menyebutkan bahwa bakteri e-coli memiliki hasil  warna merah dan bentuknya bulat ini sesuai dengan literature, dimana  Bakteri Escherichia Coli adalah bakteri gram negative, yang apabila dilakukan pewarnaan secara gram akan menghasilkan warna merah.  Berbentuk batang  sampai bulat yang tidak membentuk spora yang merupakan flora normal di usus. Bakteri Escherichia Coli umumnya merupakan bakteri patogen yang banyak ditemukan pada saluran pencernaan manusia (Anonim, 2013).
Bakteri s-aureus memiliki warna ungu dan bentuk berkoloni. Hal ini juga sudah sesuai dengan literature yang dibaca dimana,bakteri s-aureus merupakan bakteri gram positif.  Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu dibawah mikroskop (Aditya, 2010). Bakteri Staphylococu Aureus berbentuk bulat menyerupai bentuk buah anggur yang tersusun rapi dan tidak teratur satu sama lain (Anonim, 2014).
4.      Kelompok 4
Hasil praktikum kelompok 4 menyebutkan bahwa bakteri e-coli memiliki hasil  warna merah dan bentuknya bulat ini sesuai dengan literature, dimana  Bakteri Escherichia Coli adalah bakteri gram negative, yang apabila dilakukan pewarnaan secara gram akan menghasilkan warna merah.  Berbentuk batang  sampai bulat yang tidak membentuk spora yang merupakan flora normal di usus. Bakteri Escherichia Coli umumnya merupakan bakteri patogen yang banyak ditemukan pada saluran pencernaan manusia (Anonim, 2013).
Bakteri s-aureus memiliki warna ungu dan bentuk berkoloni. Hal ini juga sudah sesuai dengan literature yang dibaca dimana,bakteri s-aureus merupakan bakteri gram positif.  Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu dibawah mikroskop (Aditya, 2010). Bakteri Staphylococu Aureus berbentuk bulat menyerupai bentuk buah anggur yang tersusun rapi dan tidak teratur satu sama lain (Anonim, 2014).



            Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar yaitu gram positif dan gram negative, berdasarkan sifat kimia dan fisika dinding sel mereka.
Bakteri Escherichia Coli adalah bakteri gram negative yang apabila dilakukan pewarnaan menghasilkan warna merah, berbentuk batang yang tidak membentuk spora yang merupakan flora normal di usus. Bakteri Escherichia Coli umumnya merupakan bakteri patogen yang banyak ditemukan pada saluran pencernaan manusia. Bakteri Staphylococu Aureus adalah bakteri gram positif jika dilakukan pewarnaan secara gram menghasilkan warna ungu, bersifat aerob fakultatif, tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun kelompok, dengan diameter sekitar 0,8-1,0 µm. Bakteri Staphylococu Aureus berbentuk bulat menyerupai bentuk buah anggur yang tersusun rapi dan tidak teratur satu sama lain






Demikian yang dapat kami jelaskan tentang “ Pewarnaan Secara Gram ”. Tentunya masih banyak kekurangan dan kelemahannya, karena kurangnya referensi yang ada hubungannya dengan judul laporan ini.
            Kami banyak berharap para pembaca sudi memberikan kritik dan saran yang membangun kepada kami demi sempurnanya laporan ini dan laporan berikutnya. Semoga laporan ini berguna bagi penulis khususnya dan juga para pembaca yang budiman pada umumnya.





Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri. Jakarta : PT. Gramedia.
Hadiutomo, R.S.1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.
Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007. Elemenets of Microbiology. Mc Graw Hill Book   Company: New York.
Razali, U. 1987. Mikrobiologi Dasar. Jatinangor: FMIPA UNPAD.
Sutedjo, dkk. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rineka Cipta.
Sutedjo, Mulyani, dkk. 1996. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rineka Cipta.
Volk &Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : Jakarta
Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang : Universitas Muhammadiyah.









                      
  
                Gambar 1. Inkulum bakteri                  Gambar 2. Pengambilan inkulum bakteri

                
                 Gambar 3. Pewarnaan bakteri                          Gambar 4. Proses Fiksasi


Tidak ada komentar:

Posting Komentar