Puji syukur kami panjatkan
kehadirat Allah S.W.T tuhan yang maha Esa, karena atas berkat rahmat dan
hidayah-Nya kami dapat menyelesaikan Laporan Mikrobiologi Pangan ini. Pokok
bahasan dalam praktikum ini yaitu “ Pewarnaan Secara Gram ”.
Kami
menyadari dalam laporan ini masih banyak kesalahan dan kekurangan. Oleh karena
itu kami mengharapkan kritik dan saran, demi perbaikan dan kesempurnaan laporan
kami selanjutnya. Semoga laporan ini dapat bermanfaat bagi kami khususnya dan
pembaca pada umumnya.
Jember, 26 September 2015
Penulis
Zat
warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.
Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif.
Senyawa-senyawa kimia ini berfungsi untuk membedakan bakteri-bakteri karena
reaksinya dengan sel bakteri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah
yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo, 1991).
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi
mula-mula diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau
pewarnaa, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaaan
gram bertingkat adalah suatu cara kerja pewarnaan yang paling berguna dalam
bakteriologi. Dengan menggunakan cara kerja ini maka bakteri dapat digolongkan
menjadi dua golongan yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif
(Sutedjo, 1996: 308).
Perbedaan
dalam pewarnaaan ini disebabkan oleh adanya variasi dalam lapisan permukaan
atau dinding dari kedua jenis sel.
Sel-sel
bakteri yang bersifat gram positif adalah bakteri yang mengikat zat warna dasar
(utama) dengan kuat, sehingga tidak dapat dilunturkan oleh zat peluntur dan tidak dapat diwarnai lagi oleh zat lawan.
Pada pengamatan mikroskopik, sel-sel bakteri gram positif berwarna biru ungu
(violet), sedangkan bakteri gram negative adalah bakteri yang daya pengikatan
zat warna dasarnya tidak kuat, sehingga dapat dilunturkan dan dapat diwarnai
kembali oleh zat warna lawan, pada pengamatan mikroskopik sel-sel bakteri ini
tampak berwarna merah (Sutedjo, 1996: 308). Untuk mengetahui sifat, perbedaan
warna sel dan bentuk sel pewarnaan bakteri secara gram baik positif maupun
negatife maka dilakukan praktikum ini.
1. Melakukan
pewarnaan bakteri secara gram.
2. Mengidentifikasi
sifat gram dari bakteri.
3. Memperjelas
bentuk morfologis bakteri.
4. Melihat
struktur luar dalam sel.
5. Memperjelas
bentuk dan ukuran.
Bakteri merupakan
organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil, bentuk
tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran
1.000 kali atau lebih (Waluyo, 2004).
Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat
berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri
merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri
bermacam- macam yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering
diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah
diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan keadaan
struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat berbentuk seperti
bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan, 2007).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya
berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif.
Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena
reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah
yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi
menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan
positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada
ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen
blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya
adalah Cl-, SO4-, CH3COO-,
COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat
dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan
bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor
seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan
penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991).
Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan
Gram dan Ziehl‐Nelsen.
Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik
bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur
pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan
larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah
alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna
biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ungu.
Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus,
Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll.
Sedangkan bakteri Gram negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian
safranin akan memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri
Gram negative adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella,
Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman, 1983).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion
antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang
disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik
pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan
yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan
sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai
serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode
pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar
dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan
sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta
meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan warna
pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana,
pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri
atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna
pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan
sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel
mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial
(Pelczar & Chan, 2007).
Proses pewarnaan gram
ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan
pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan
ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut
warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas.
Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci
tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen
dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila
komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci.
Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna
pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.
Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol dan
safranin (Tracy, 2005).
2. Kaca
benda
3. Mangkuk
pewarna
4. Kawat
Penyangga
5. Pipet
6. Pinset
7. Lampu
spirtus
8. Botol
Penyemprot
1. Aquades
steril
2. Biakan
murni bakteri (E.coli dan S. Aureus) umur 1x24 jam
3. Larutan
ammonium
4. Oksalat kristal violet
5. Kertas penghisap
6. Korek api
7. Alkohol 70%
8. Alkohol 95%
9. Lisol
10. Sabun cuci
11. Larutan safranin
12. Larutan iodium
Tabel
1. Hasil Pengamatan
No.
|
Nama koloni
|
Bentuk
|
Warna
|
Gambar
|
1.
|
E-Coli
|
Tidak
beraturan
|
Bening
|
|
2.
|
S-Aureus
|
Bulat
|
Merah
|
|
3.
|
E-Coli
|
Berkoloni
|
Bening
|
|
4.
|
S-Aureus
|
Tidak
beraturan
|
Ungu
|
|
5.
|
E-Coli
|
Bulat
|
Merah
|
|
6.
|
S-Aureus
|
Berkoloni
|
Ungu
|
|
7.
|
E-Coli
|
Bulat
|
Merah
|
|
8.
|
S-Aureus
|
Bulat
|
Ungu
|
|
Mikroorganisme
yang ada dialam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas,
begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan
kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara
untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah
dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk
mengetahui sifat fisiologis yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui
serangkaian pengecatan. Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali
microalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan
jelas (Hadiutomo, 1990).
Bakteri
yang akan dilakukan pewarnaan yaitu bakteri Escherichia Coli dan bakteri
Staphylococus Aureus. Bakteri Escherichia Coli adalah bakteri gram negative
berbentuk batang yang tidak membentuk spora yang merupakan flora normal di
usus. Bakteri Escherichia Coli umumnya merupakan bakteri patogen yang banyak
ditemukan pada saluran pencernaan manusia (Anonim, 2013). Bakteri Staphylococus
Aureus adalah bakteri gram positif yang menghasilkan pigmen kuning, bersifat
aerob fakultatif, tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh
berpasangan maupun kelompok, dengan diameter sekitar 0,8-1,0 µm. Bakteri
Staphylococus Aureus berbentuk bulat menyerupai bentuk buah anggur yang
tersusun rapi dan tidak teratur satu sama lain (Anonim, 2014).
Pewarnaan gram atau
metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar yaitu gram positif dan gram negative, berdasarkan
sifat kimia dan fisika dinding sel mereka. Metode ini diberikan nama
berdasarkan nama penemunya yaitu ilmuan Denmark Hans Christian Gram 1853-1938
yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan Pneumokokus dan
bakteri Kebsiella Pneumonia (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk
mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati
struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna
yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui
(Hadiutomo, 1990).
Perbedaan dua kelompok
bakteri ini (gram positif dan gram negatif) didasarkan pada kemampuan sel
menahan (mengikat) warna ungu dari Kristal Violet selama proses deklorisasi
oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap
mengikat warna ungu Kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak
terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol
dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin (Anonim,
2013).
Menurut ilmuan Denmark
Hans Christian Gram (1853-1938), dalam melakukan pewarnaan gram diperlukan
empat macam pewarnaan dengan fungsi yang berbeda yaitu :
1. Pewarnaan
primer yaitu pewarnaan yang berfungsi dapat memberikan warna pada semua
bakteri.
2. Pengikat
yaitu memperkuat ikatan kompleks antara pewarna dengan komponen dinding
bakteri.
3. Penghilang
warna (peluntur warna) yaitu memiliki fungsi untuk melarutkan sisa zat warna
dan kompleks zat warna dengan lipid pada dinding bakteri.
4. Pewarna
pengganti yaitu memberikan warna pada dinding bakteri yang kehilangan pewarna
primernya.
Pada
praktikum pewarnaan secara gram dapat dilakukan dengan langkah kerja sebagai
berikut langkah pertama yaitu siapkan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan
diatas api Bunsen/ spirtus untuk mematikan kehidupan pada kaca benda tersebut.
Teteskan satu tetes aquades steril di atas kaca benda tersebut, secara aseptic
ambillah inkulum bakteri yang akan di periksa dengan cara memijarkan jarum ose,
lalu letakkan diatas tetesan Aquades steril. Kemudian ratakan pelahan-lahan dan
tunggulah sampai kering. Setelah sediaan
kering maka tahap selanjutnya yaitu melakukan fiksasi dengan cara melewatkan
bagian bawah dari kaca benda diatas api spirtus. Setelah itu sediaan siap untuk
di warnai.
Letakkan
sediaan diatas bak pewarna (mangkuk), lalu teteskan Amoniumoksalat Kristal
Violet diatasnya tunggu selama 1 menit. Pada praktikum ini Kristal Violet
merupakan pewarna primer yang berfungsi untuk memberikan warna pada semua
bakteri. Setelah 1 menit buanglah kelebihan zat warna tersebut ke dalam bak
pewarna dan bilaslah sediaan dengan air kran yang mengalir. Pembilasan kaca
benda menggunakan air kran yang mengalir bertujuan untuk mengurangi kelebihan
setiap zat warna yang sedang diberikan.
Teteskan larutan iodium diatas sediaan tersebut, lalu tunggu selama 2
menit. Larutan iodium ini berfungsi untuk menginterpretasikan warna. Buanglah
kelebihan larutan iodium kedalam mangkuk dan bilas sediaan dengan air kran yang
mengalir. Langkah selanjutnya yaitu teteskan Alkohol 95% di atas sediaan dan
biarkan selama 1 menit, dimana Alkohol 95% pada praktikum ini bertujuan untuk
melunturkan warna. Buanglah sisa Alkohol 95% ke dalam bak pewarna, lalu bilaslah
dengan air kran yang mengalir. Langkah pewarnaan yang terakhir yaitu teteskan
larutan safranin diatas median, biarkan selama 30 detik. Larutan safranin
merupakan pewarna tertutup pada praktikum ini, dimana pewarna tertutup
(pengganti) berfungsi untuk memberikan warna pada dinding bakteri yang
kehilangan pewarna primernya. Keringkan sediaan dengan kertas penghisap (tisu)
secara hati-hati. Penyerapan air bilasan dengan menggunakan kertas tisu
bertujuan untuk agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau perwarna baru
yang akan diberikan. Setelah proses pewarnaan selesai, langkah selanjutnya
yaitu pengamatan sediaan dibawah mikroskop untuk melihat bentuk dan warna dari
bakteri yang diamati. Pemberian laergen
atau pewarna pengganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang
telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan
dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang
waktu pemberian zat warna yang satu ke lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi
bakteri berlangsung cepat.
Bakteri
yang digunakan pada praktikum pewarnaan secara gram ini yaitu bakteri e-coli
dan s-aureus dimana setiap kelompok ada mengalami kegagalan saat praktikum.
Adapun hasil-hasilnya sebagai berikut :
1. Kelompok
1
Untuk
bakteri e-coli pada kelompok 1 berbentuk tidak beraturan dan memiliki warna
bening. Hal ini tidak sesuai dengan literature dimana bakteri e-coli bersifat
gram negative yang seharusnya memiliki warna merah. Kegagalan ini disebabkan
karena pada saat pengambilan bakteri yang diulas pada kaca benda terlalu padat
terutama bila suspensi tersebut berasal dari bukan media padat. Seharusnya
jumlah bakteri yang diulas pada kaca benda yang sebelumnya ditetesi aquades
steril pengulasannya secara merata atau satu arah (sutedjo,1991).
Untuk
bakteri s-aureus memiliki bentuk bulat dan berwarna merah. Bakteris-aureus
merupakan bakteri yang bersifat gram positif, dimana pada saat pewarnaan secara
gram menghasilkan warna ungu. Sedangkan hasil praktikum diketahui bahwa bakteri
s-aureus berwarna merah. Hal ini tidak sesuai dengan sifat dari bakteri
s-aureus dan literature. Menurut ilmuan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938)
menyebutkan bahwa bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metal ungu
gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative
tidak.
2. Kelompok
2
Untuk
bakteri e-coli pada kelompok 2 berbentuk tidak beraturan dan memiliki warna
bening. Hal ini tidak sesuai dengan literature dimana bakteri e-coli bersifat
gram negative yang seharusnya memiliki warna merah. Kegagalan ini disebabkan
karena pada saat pengeringan dengan kertas tisu pada kaca benda sebelum
dilakukan pengamatan mikroskop tidak dilakukan secara hati-hati. Seharusnya
jumlah bakteri yang diulas pada kaca benda yang sebelumnya ditetesi aquades
steril pengulasannya secara merata atau satu arah (sutedjo,1991).
Bakteri
s-aureus berbentuk tidak beraturan titik. Memiliki warna ungu. Untuk warna
bakteri ini sudah sesuai literature yang menyebutkan bahwa bakteri gram positif
adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metal ungu sewaktu proses
pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu dibawah
mikroskop (Aditya, 2010). Bentuk dari bakteri s-aureus pada saat praktikum
yaitu tidak beraturan hal ini tidak sesuai dengan literature yang menyebutkan
bahwa bakteri Staphylococu Aureus berbentuk bulat menyerupai bentuk buah anggur
yang tersusun rapi dan tidak teratur satu sama lain (Anonim, 2014).
3. Kelompok
3
Hasil
praktikum kelompok 3 menyebutkan bahwa bakteri e-coli memiliki hasil warna merah dan bentuknya bulat ini sesuai
dengan literature, dimana Bakteri
Escherichia Coli adalah bakteri gram negative, yang apabila dilakukan pewarnaan
secara gram akan menghasilkan warna merah.
Berbentuk batang sampai bulat
yang tidak membentuk spora yang merupakan flora normal di usus. Bakteri
Escherichia Coli umumnya merupakan bakteri patogen yang banyak ditemukan pada
saluran pencernaan manusia (Anonim, 2013).
Bakteri
s-aureus memiliki warna ungu dan bentuk berkoloni. Hal ini juga sudah sesuai
dengan literature yang dibaca dimana,bakteri s-aureus merupakan bakteri gram
positif. Bakteri gram positif adalah
bakteri yang mempertahankan zat warna metal ungu sewaktu proses pewarnaan gram.
Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu dibawah mikroskop (Aditya,
2010). Bakteri Staphylococu Aureus berbentuk bulat menyerupai bentuk buah
anggur yang tersusun rapi dan tidak teratur satu sama lain (Anonim, 2014).
4. Kelompok
4
Hasil
praktikum kelompok 4 menyebutkan bahwa bakteri e-coli memiliki hasil warna merah dan bentuknya bulat ini sesuai
dengan literature, dimana Bakteri
Escherichia Coli adalah bakteri gram negative, yang apabila dilakukan pewarnaan
secara gram akan menghasilkan warna merah.
Berbentuk batang sampai bulat
yang tidak membentuk spora yang merupakan flora normal di usus. Bakteri
Escherichia Coli umumnya merupakan bakteri patogen yang banyak ditemukan pada
saluran pencernaan manusia (Anonim, 2013).
Bakteri
s-aureus memiliki warna ungu dan bentuk berkoloni. Hal ini juga sudah sesuai
dengan literature yang dibaca dimana,bakteri s-aureus merupakan bakteri gram
positif. Bakteri gram positif adalah
bakteri yang mempertahankan zat warna metal ungu sewaktu proses pewarnaan gram.
Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu dibawah mikroskop (Aditya,
2010). Bakteri Staphylococu Aureus berbentuk bulat menyerupai bentuk buah
anggur yang tersusun rapi dan tidak teratur satu sama lain (Anonim, 2014).
Pewarnaan
gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar yaitu gram positif dan gram negative,
berdasarkan sifat kimia dan fisika dinding sel mereka.
Bakteri Escherichia Coli adalah
bakteri gram negative yang apabila dilakukan pewarnaan menghasilkan warna
merah, berbentuk batang yang tidak membentuk spora yang merupakan flora normal
di usus. Bakteri Escherichia Coli umumnya merupakan bakteri patogen yang banyak
ditemukan pada saluran pencernaan manusia. Bakteri Staphylococu Aureus adalah bakteri
gram positif jika dilakukan pewarnaan secara gram menghasilkan warna ungu,
bersifat aerob fakultatif, tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya
tumbuh berpasangan maupun kelompok, dengan diameter sekitar 0,8-1,0 µm. Bakteri
Staphylococu Aureus berbentuk bulat menyerupai bentuk buah anggur yang tersusun
rapi dan tidak teratur satu sama lain
Demikian
yang dapat kami jelaskan tentang “ Pewarnaan
Secara Gram ”. Tentunya masih banyak kekurangan dan kelemahannya, karena
kurangnya referensi yang ada hubungannya dengan judul laporan ini.
Kami banyak berharap para pembaca
sudi memberikan kritik dan saran yang membangun kepada kami demi sempurnanya
laporan ini dan laporan berikutnya. Semoga laporan ini berguna bagi penulis
khususnya dan juga para pembaca yang budiman pada umumnya.
Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri. Jakarta : PT. Gramedia.
Hadiutomo, R.S.1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.
Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007. Elemenets of Microbiology. Mc Graw Hill
Book Company: New York.
Razali, U. 1987. Mikrobiologi
Dasar. Jatinangor: FMIPA UNPAD.
Sutedjo, dkk. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rineka
Cipta.
Sutedjo, Mulyani,
dkk. 1996. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rineka Cipta.
Volk &Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Penerbit
Erlangga : Jakarta
Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang : Universitas Muhammadiyah.
Gambar 1. Inkulum bakteri
Gambar 2. Pengambilan inkulum bakteri
Gambar 3. Pewarnaan bakteri Gambar 4. Proses Fiksasi